Diagnostic moléculaire de l'origine des contaminations fécales dans l'environnement littoral - Développement de marqueurs Bacteroidales spécifiques de l'hôte

Les fèces d’animaux d’élevage et les effluents d’origine urbaine ou agricole sont les principales sources de contamination microbiologique participant à la dégradation de la qualité des eaux et des coquillages et à l’apport de pathogènes entériques dans l’environnement. La nouvelle directive européenne concernant les eaux de baignade (2006/7/CE) impose pour début 2011 la mise en place de profils de baignade avec une identification et une hiérarchisation des sources de contamination fécale des eaux. Les indicateurs classiques de contamination fécale, Escherichia coli et les entérocoques intestinaux, permettent de mettre en évidence une contamination mais pas d’en identifier l’origine. Ainsi, des méthodes alternatives, dont celles basées sur la recherche de microorganismes cibles tels que les bactéries appartenant à l’ordre des Bacteroidales ont été développées ou sont en cours de développement pour identifier l’origine humaine ou animale des contaminations. Les premiers marqueurs Bacteroidales, développés pour la PCR conventionnelle, ont généralement été très peu détectés dans les eaux de l’environnement et ils n’ont, à notre connaissance, pas été appliqués sur des coquillages. L’objectif principal de ce travail de thèse était de développer et de valider une approche moléculaire basée sur la PCR quantitative en temps réel, pour permettre l’identification de l’origine des contaminations dans les eaux et les coquillages à partir de la cible Bacteroidales. L’analyse phylogénétique des séquences de gène codant les ARNr 16S des Bacteroidales issues de fèces et d’effluents d’origine humaine, porcine, bovine et de fientes d’oiseaux sauvages a permis de développer quatre marqueurs Bacteroidales, pour identifier les contaminations fécales humaines (Hum-1-Bac), porcines (Pig-1-Bac et Pig-2-Bac) et ruminants (Rum-2-Bac). Appliqués dans des échantillons de fèces et d’effluents, ces marqueurs se sont révélés hautement sensibles (92,3 - 100 %) et spécifiques (93,4 - 100 %). L’étude de la persistance des marqueurs Pig-1-Bac et Pig-2-Bac, en microcosmes d’eau de rivière, a montré que sous les conditions les plus défavorables, saturation en oxygène dissous et température de 20°C, les marqueurs persistaient au moins 16 jours. Ces résultats suggèrent que les marqueurs Bacteroidales peuvent persister assez longtemps dans les eaux de rivière pour être identifiés. Cette hypothèse a été confirmée par leur quantification dans des eaux de rivière et des eaux estuariennes provenant du bassin versant de l’estuaire de Daoulas et de l’estuaire de l’Elorn (Finistère, Bretagne) à des concentrations comprises entre 2,7 et 6,5 U. Log10 copies/100 ml. Comparés à des marqueurs bactériens, viraux et chimiques à partir d’eaux de ruissellement et de l’environnement, les marqueurs Bacteroidales se sont avérés pertinents pour identifier l’origine des contaminations. Les marqueurs Bacteroidales spécifiques de l’hôte ont également été recherchés dans les coquillages. La sélection et l’optimisation d’un protocole d’extraction d’ADN génomique bactérien à partir des liquides intervalvaires d’huîtres artificiellement contaminées a ensuite permis de détecter et de quantifier les marqueurs dans des huîtres naturellement contaminées. La discrimination de l’origine des contaminations fécales à partir d’échantillons d’eaux et de liquides intervalvaires d’huîtres provenant des deux sites sélectionnés dans cette étude a souligné l’importance des contaminations fécales d’origine humaine et ruminant par rapport aux contaminations d’origine porcine. Cette étude, confirme ainsi l’intérêt d’utiliser des marqueurs spécifiques de l’hôte, développés à partir de la cible Bacteroidales, pour identifier l’origine des contaminations fécales au niveau des zones de baignade et des zones conchylicoles.